Wpływ doxazosyny na ekspresję receptorów błonowych indukujących apoptozę w pierwotnej hodowli komórek nabłonkowych stercza, u chorych z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego

Streszczenie pracy doktorskiej
Promotor: prof. dr hab. n. med. Zbigniew Wolski

Wprowadzenie

Komórki nabłonkowe stercza mają na swej powierzchni liczne receptory wpływające na proces zaprogramowanej śmierci komórki (apoptozy). Doxazosyna zapoczątkowuje apoptozę wykorzystując mechanizmy drogi receptorów z rodziny czynnika martwicy nowotworu TNF (Tumor Necrosis Factor). Wyróżniamy wśród nich receptory TNFR-1 i TNFR-2 oraz FAS (CD95) i CD40.

Cel pracy

Celem pracy jest określenie wpływu różnych stężeń doxazosyny na ekspresję receptorów TNFR-1, TNFR-2, CD95 i CD40 jako wykładników zdolności indukcji apoptozy w pierwotnej hodowli komórek nabłonkowych stercza u pacjentów z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego.

Materiał i metoda

Materiał do badania pobrano od 14 pacjentów. 10 próbek pochodziło ze strefy przejściowej wyłuszczonego gruczołu krokowego podczas adenomektomii, 2 pobrano podczas przezcewkowej elektroresekcji stercza i 2 z biopsji stercza. Udało się założyć 10 hodowli tylko z materiału uzyskanego od pacjentów poddanych zabiegowi adenomektomii. Prawdopodobną przyczyną niepowodzeń izolacji komórek ze skrawków biopsyjnych była zbyt mała ich ilość w materiale, natomiast dwie próbki uzyskane podczas elektroresekcji wykazywały znaczne uszkodzenie komórek. Uszkodzenia te powstały prawdopodobnie na skutek działania prądu używanego podczas elektroresekcji. Średni wiek mężczyzn wynosił 65,8±6,6 lat. Tkankę pocięto na fragmenty objętości ok. 1 mm3 i umieszczono w kąpieli enzymatycznej na 8 godzin. Po strawieniu zawiesinę komórek umieszczono w 25 cm3 butelce hodowlanej (Greiner). Hodowla była prowadzona z użyciem pożywki podstawowej DMEM (Dulbeco Minimal Essential Medium - Sigma) wzbogaconej czynnikami wzro-stu i mikroelementami oraz suplementowanej surowicą płodową wołową FBS (Fetal Bovine Serum - Sigma). Charakter nabłonkowy komórek potwierdzono testem z użyciem przeciwciał przeciwko pancytokeratynie (DAKO). Wyhodowane komórki podzielono na cztery grupy. Do trzech dodano doxazosynę (Pfizer)wstężeniach20 µM/l, 50 µM/l i 80 µM/l. Stężenia przeliczono na hipotetyczne dawki stosowane w praktyce klinicznej i odpowiadały one dawkom przyjmowanym doustnie - 8, 16 i 32 mg tabletek. Obliczenie hipotetycznych dawek klinicznych nie miało wpływu na dobranie stężeń doxazosyny do badania. Kontrolę stanowiły komórki, do których dodano zbuforowany roztwór soli fizjologicznej(PBS).Komórkiinkubowano 24 godziny z doxazosyną. Po 48 godzinach komórki odklejono od podłoża i w ilości 4 x 105 zawieszono w 25 µl PBS. Dodano 1 µg ludzkich IgG na 15 min, celem inaktywacji fragmentu Fc przeciwciał. Następnie po przepłukaniu umieszczono zawiesinę na 40 min w temperaturze 40C z 10µl przeciwciał połączonych z fikoerytryną (PE) anti-Fas-PE, anti-CD40-PE (BD Biosciences, UK) lub fluoresceiną (FITC) anti-TNFR-1-FITC, anti-TNFR-2-FITC (R&D Systems, UK). Grupę kontrolną stanowiły komórki inkubowane z przeciwciałami IgG połączonymi z PE lub FITC. Po 40-minutowej inkubacji w temperaturze 40C komórki przepłukano, odwirowano i próbki dopełniono 400 µl PBS, a następnie poddano analizie w cytometrze przepływowym Epics XL (System 2 Software Version 1.0). Wykonano trzy pomiary dla każdej próbki. Wyniki zostały opracowane statystycznie.

Wyniki

Uzyskano 10 hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych stercza. We wszystkich badanych grupach zaobserwowano komórki będące we wczesnym etapie apoptozy. Na powierzchni komórek receptor TNFR-1 występował w 61,3±28,4% w grupie kontrolnej oraz 77,0±5,4% w grupie inkubowanej z 80 µM/l (Dox-80) doxazosyny (p=0,01). Wykazano dodatnią korelację pomiędzy dawką doxazosyny a ilością komórek mających na swej powierzchni receptory TNFR-1 i TNFR-2 (korelacja 0,994). Zaobserwowano obniżenie ilości receptorów CD40 na powierzchni komórek inkubowanych z doxazosyną w najmniejszym stężeniu (Dox-20) 404±67% w stosunku do kontroli 53,4±19,9% (p=0,001). Zauważono obniżenie średniej wartości sygnału receptorów CD40 i CD95 w grupie z najmniejszym stężeniem doxazosyny (Dox-20). Wykazano po raz pierwszy, że białko CD40 może mieć znaczenie w rozpoczęciu procesu apoptozy w komórkach nabłonka stercza indukowanego doxazosyną.

Wnioski

• Stwierdzono wpływ doxazosyny na indukcję procesu apoptozy w hodowli komórek nabłonka stercza pobranych od pacjentów z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego.
• Najlepszym materiałem do hodowli komórek nabłonka stercza jest materiał pobrany podczas zabiegu adenomektomii, a nie przezcewkowej elektroresekcji czy biopsji stercza.
• Opracowano metodykę uzyskania hodowli nabłonka stercza z materiału pobranego od pacjentów poddanych zabiegowi adenomektomii.
• Zastosowanie już najniższego stężenia doxazosyny 20 µM/l działającego na ludzkie komórki nabłonkowe stercza w hodowli jest wystarczające do zainicjowania procesu apoptozy.
• Eksperymentalnie wyznaczone dawki doxazosyny przekraczające dwu- i trzykrotnie dawki stosowane klinicznie mają większą zdolność indukowania apoptozy.
• Stwierdzono, że rozpoczęciu zjawiska apoptozy w ludzkich komórkach nabłonkowych stercza towarzyszy zwiększenie ilości receptorów zapoczątkowujących szlak apoptozy - TNFR-1 i TNFR-2.
• Wykazano po raz pierwszy, że białko CD40 jako cząsteczka modulująca może mieć istotne znaczenie w rozpoczęciu procesu apoptozy w komórkach nabłonkowych stercza po indukcji doxazosyną.
• Przedstawiony własny model badawczy oraz metoda uzyskania hodowli komórek nabłonkowych stercza mogą być wykorzystywane do oceny innych leków wpływających na apoptozę i stosowanych w chorobach stercza.

dr n. med. Bartosz Misterek
Katedra i Klinika Urologii Ogólnej, Onkologicznej i Dziecięcej Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy