Przegląd Urologiczny 2012/1 (71) wersja do druku | skomentuj ten artykuł | szybkie odnośniki
 
strona główna > archiwum > Przegląd Urologiczny 2012/1 (71) > Zastosowanie mysiej ustalonej linii komórek...

Zastosowanie mysiej ustalonej linii komórek dendrytycznych JAWS II w immunoterapii czerniaka u myszy

Streszczenie pracy doktorskiej Promotor: prof. dr hab. n. med. Witold Lasek

Streszczenie

Komórki dendrytyczne są jednymi z najważniejszych komórek prezentujących antygen, mającymi krytyczne znaczenie dla zainicjowania swoistej odpowiedzi immunologicznej. Do tkanek docierają one w formie niedojrzałej i bez obecności stymulacji zapalnej lub bakteryjnej, a większość z nich wykazuje silne właściwości fagocytarne oraz niską ekspresję cząsteczek MHC klasy II oraz markerów powierzchniowych CD80/86 i CD40, niezbędnych do kostymulacji komórek odpowiedzi immunologicznej. Na drodze endocytozy i pinocytozy pochłaniają i przetwarzają antygeny peptydowe, które następnie w węzłach limfatycznych prezentują limfocytom, włączając je do odpowiedzi immunologicznej.

Zakłada się, że podając odpowiednią liczbę tych komórek, jako szczepionek komórkowych zdolnych do prezentacji antygenów nowotworowych, możliwe jest wywołanie efektywnej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Rozpoznanie antygenu przy nieobecności odpowiednich cząsteczek kostymulujących prowadzi jednak do zahamowania aktywacji limfocytów T cytotoksycznych, a nawet może wywołać powstanie komórek regulatorowych i indukcję tolerancji. Z tego powodu w kontekście ich aplikacji in vivo niezmiernie istotna pozostaje kwestia stworzenia optymalnych warunków do ich dojrzewania. Poza „karmieniem” komórek dendrytycznych peptydami czy lizatami komórek nowotworowych, jedną z możliwych metod wpływania na ich aktywację jest poddawanie ich działaniu immunostymulatorów egzogennych.

Linia JAWS II, stanowiąca przedmiot badań w niniejszej rozprawie, wydaje się być szczególnie obiecująca jako kandydat do terapii nowotworów szczepionkami komórek dendrytycznych w modelu mysim. W literaturze brakuje informacji dokładnie charakteryzujących te komórki, w tym określających, jakie mają receptory powierzchniowe. Określenie wybranych receptorów powierzchniowych i zbadanie panelu wydzielanych cytokin przez komórki JAWS II pod wpływem immunomodulatorów może przynieść odpowiedź co do użyteczności tych komórek w leczeniu eksperymentalnych nowotworów w warunkach in vivo.

W niniejszych badaniach zaobserwowano, że hodowle komórek JAWS II stanowiły heterogenną populację komórek, złożoną z komórek luźno przylegających do powierzchni butelki, bądź rosnących w zawieszeniu. Analiza na FACS wykazała, że niestymulowane komórki JAWS II mają w błonie cząsteczki CD80, CD86, F4/80 oraz cząsteczki MHC klasy I. Ekspresja cząsteczek MHC klasy II była zmienna. Wykazano także śladową ekspresję receptorów CD11c, CD40 oraz CCR7. Subpopulacja komórek nieprzylegających charakteryzowała się niewielką ekspresją cząsteczek CD11c i MHC klasy II, które były nieobecne na komórkach przylegających. Obie subpopulacje nie różniły się natomiast liczbą receptorów CD40 obecnych w błonie komórkowej.

Ponieważ warunkiem koniecznym do wypełnienia dla optymalnej funkcji DC jest, poza obecnością cząsteczek MHC, ekspresja niektórych powierzchniowych cząsteczek kostymulujących, zwłaszcza CD40 i CD80/CD86, zbadano wpływ egzogennych ligandów i cytokin na cechy fenotypowe komórek JAWS II. W badaniach określano efekt działania na te komórki następujących immunostymulatorów: IL-12, IL-15, lipopolisacharydu (LPS) - agonisty TLR4, kwasu poliryboinozyno-polirybocytydylowego (poli I:C) - agonisty TLR3, oligodeoksynukleotydu 1826 (ODN 1826) - agonisty TLR9, a także IFN-γ, TNF-α i IL-4 (pojedynczo i w kombinacjach). Najsilniej stymulująco na ekspresję markerów powierzchniowych komórek JAWS II wpływał IFN-γ. Dodatkowe dołączenie poli I:C do IFN-γ w sposób istotny zwiększało ilość cząsteczek MHC klasy I, CD11c oraz CD86 w błonie komórek JAWS II, a także ekspresję CD40 i CCR7.

W dalszych eksperymentach zbadany został wpływ stymulacji na ekspresję receptorów TLR w komórkach JAWS II: TLR1, 2, 4 i 6 (receptory powierzchniowe) oraz TLR3, 7 i 9 (receptory wewnątrzkomórkowe). Analiza FACS ujawniła dużą ilość TLR1 na powierzchni komórek JAWS II. Zaobserwowano ponadto zwiększenie ekspresji tego receptora pod wpływem LPS i IFN-γ oraz w kombinacjach cytokin z IFN-γ. Analiza FACS nie wykazała obecności TLR2 w błonie niestymulowanych komórek JAWS II. Stymulatory: LPS, ODN 1826, IFN-γ oraz - w największym stopniu - poli I:C, indukowały jednak pojawianie się tego receptora. Komórki JAWS II miały niewielką ilość receptorów TLR4 i TLR6; zastosowane stymulatory nie wpływały na zmianę ich ekspresji. Metodą Western-blotting wykazano silną ekspresję receptorów TLR3 i TLR7 w komórkach JAWS II, natomiast nie ujawniono obecności TLR9. Inkubacja z wybranymi stymulatorami nie wpływała na ekspresję wymienionych receptorów.

W badaniach dotyczących komórek JAWS II określono także właściwości endocytarne tych komórek. LPS powodował zmniejszenie właściwości endocytarnych zarówno w hodowli 24-, jak i 48-godzinnej. Zaobserwowano natomiast, że zastosowanie łączne poli I:C oraz IFN-γ silniej od LPS (podczas inkubacji 48-godzinnej) ograniczało pochłanianie znacznika FITC-dekstran przez komórki.

Następnie badane było wytwarzanie cytokin przez komórki JAWS II. Komórki niestymulowane produkowały niewielkie ilości IL-6, TNF-α i chemokiny MCP-1. Inkubacja tych komórek z LPS lub poli I:C zmieniała istotnie ich zdolności do wydzielania cytokin: zarówno po inkubacji z LPS, jak i poli I:C, poziom wymienionych cytokin osiągnął stężenie kilku ng/ml, a nawet >5 ng/ml. W testach immunoenzymatycznych ELISA, zarówno w supernatantach z hodowli komórek JAWS II, jak i w lizatach tych komórek, wykazano obecność IL-15, nie wykryto natomiast IL-12.

Celem zbadania możliwości migracji komórek JAWS II do regionalnych węzłów chłonnych komórki te - stymulowane poli I:C i/lub IFN-γ, a następnie wyznakowane CFSE - zostały wstrzyknięte w poduszkę tylnej łapki myszy. Wykazano, że komórki JAWS II stymulowane poli I:C i IFN-γ migrowały do regionalnych węzłów chłonnych w znacznie większej liczbie niż te stymulowane wyłącznie poli I:C albo IFN-γ.

Aby określić zdolność komórek JAWS II do stymulacji dziewiczych limfocytów T, komórki JAWS II, które były „karmione” onkolizatami (linii czerniaka B78-H1) i następnie inkubowane przez 48 godzin z poli I:C +/- IFN-γ, podawane były w poduszkę tylnej łapki myszy. Znaczne ilości IFN-γ odnotowano w hodowlach limfocytów (uzyskanych z regionalnych węzłów chłonnych) restymulowanych napromienianymi komórkami czerniaka B78-H1 w grupach „poli I:C” i „poli I:C + IFN-γ”. Komórki JAWS II, które były karmione onkolizatami i inkubowane z IFN-γ, cechowały się niewielkimi zdolnościami do swoistej aktywacji przeciwnowotworowej limfocytów T (korespondującej z niskimi poziomami IFN-γ w hodowlach), zaś komórki hodowane bez stymulacji były pozbawione tych właściwości.

Przed rozpoczęciem eksperymentów in vivo na mysim modelu czerniaka sprawdzono, czy karmienie onkolizatami linii B78-H1 wraz ze stymulacją poli I:C + IFN-γ wpływa na ekspresję markerów powierzchownych linii JAWS II. W komórkach karmionych onkolizatami, a następie stymulowanych poli I:C i IFN-γ (przez 48 godzin) zaobserwowano zwiększenie ekspresji cząsteczki CD40, CD86, a także CCR7 oraz pojawienie się CD8α.

Eksperymenty in vivo prowadzone były na myszach szczepu C57BL/6, którym przeszczepiano komórki czerniaka linii B78-H1 (komórki JAWS II stanowiły w tym przypadku układ syngeniczny), bądź BALB/c, którym przeszczepiano komórki nowotworowe linii EMT6 (komórki JAWS II - układ allogeniczny). Wykonano 3 warianty doświadczeń: profilaktyczny (składniki terapii: komórki JAWS II +/- IL-12 podawane do kontrlateralnej łapki przed podaniem komórek nowotworowych) oraz 2 warianty terapeutyczne:
a) systemowy (składniki terapii podawane do kontrlateralnej łapki po inokulacji komórek nowotworowych),
b) doguzowy (składniki terapii podawane w miejsce wcześniejszego nastrzyknięcia komórek nowotworowych).

W przypadku czerniaka B78-H1, w układzie profilaktycznym podanie karmionych i stymulowanych komórek JAWS II z następczym nastrzykiwaniem myszy IL-12 wywierało skuteczny efekt profilaktyczny przeciwnowotworowy w porównaniu z grupą kontrolną i prowadziło do 86% wyleczeń oraz istotnego zmniejszenia wielkości guzów. Podawanie samych komórek JAWS II dało wynik istotnie statystycznie gorszy. Z kolei zastosowanie w połączeniu niekarmionych i niestymulowanych komórek JAWS II oraz IL-12 prowadziło także do 86% wyleczeń oraz istotnego zmniejszenia wielkości guzów.

W układzie terapeutycznym doguzowym połączenie karmionych i stymulowanych komórek JAWS II z IL-12 prowadziło do znacznego zwolnienia wzrostu guzów, w porównaniu z grupą kontrolną oraz 71% wyleczeń. W przeciwieństwie do tej grupy, w grupie, która otrzymywała wyłącznie komórki JAWS II, wszystkie myszy rozwinęły guzy. Z kolei podawanie myszom kombinacji niekarmionych i niestymulowanych komórek JAWS II + IL-12 także prowadziło do znacznego zwolnienia wzrostu guzów w porównaniu z grupą kontrolną i 86% wyleczeń.

W układzie terapeutycznym systemowym połączenie karmionych i stymulowanych komórek JAWS II z IL-12 powodowało zwolnienie wzrostu guzów w porównaniu z grupą kontrolną i umożliwiło uzyskanie 38% wyleczeń. Z kolei w doświadczeniu, w którym stosowano komórki JAWS II niekarmione i niestymulowane z IL-12, nie zaobserwowano wpływu leczenia na rozwój nowotworów.

W przypadku myszy BALB/c nastrzykiwanych komórkami EMT6, zarówno profilaktyczne, jak i terapeutyczne podawanie komórek JAWS II, niezależnie od karmienia/stymulacji, w połączeniu z IL-12, nie przyniosło efektów. Myszy ze wszystkich grup doświadczalnych rozwinęły guzy i nie zaobserwowano różnic między grupami, jeżeli chodzi o tempo pojawiania się i wielkość guzów. W ostatnim cyklu doświadczeń in vivo, w modelu czerniaka B78-H1 podawano terapeutycznie doguzowo komórki JAWS II +/- IL-15. Iniekcje karmionych i stymulowanych komórek JAWS II + IL-15 lub samej IL-15 dały taki sam odsetek wyleczeń (14%, wyniki nieistotne statystycznie). Zaobserwowano także tendencję wolniejszego wzrostu guzów w grupach, które otrzymywały IL-15. Z kolei połączenie niekarmionych i niestymulowanych komórek JAWS II z IL-15 pozwoliło uzyskać 67% wyleczeń, a samej IL-15 - 33%. Ponadto zaobserwowano mniejsze guzy w grupach, które otrzymywały IL-15.

W wykonanych doświadczeniach opracowano warunki in vitro umożliwiające dojrzewanie dostępnych komercyjnie unieśmiertelnionych mysich prekursorów DC, komórek JAWS II i pozwalające na wypełnienie ich funkcji prezentacji antygenów in vivo.


dr n. med. Łukasz Piotr Zapała
Oddział Urologii, Międzyleski Szpital Specjalistyczny
ordynator oddziału: dr n. med. Artur A. Antoniewicz