Ocena związku antagonisty receptora adrenergicznego (doksazosyny) ze szlakiem PI3-kinazy (PI3K) w progresji raka gruczołu krokowego; badania mechanizmów komórkowych in vitro

Streszczenie pracy doktorskiej laureata Nagrody im. prof. Tadeusza Krzeskiego za 2008 rok Promotor: prof. dr hab. n. med. Marek Sosnowski

Hormonooporny rak gruczołu krokowego jest chorobą nieuleczalną. Uważa się, że powstanie tej postaci nowotworu związane jest z aktywacją alternatywnych, androgenoniezależnych szlaków komórkowych. Szlak biochemiczny PI3-kinazy, PI3K/PTEN/AKT wpływa na szereg procesów związanych ze wzrostem oraz transformacją komórek i w związku z tym ma bardzo istotne znaczenie w progresji wielu nowotworów, m.in. glejaków, raka piersi, jajnika, nerki, a ostat-nio jest opisywany jako dominujący czynnik w progresji raka stercza (PCa). W licznych badaniach zaobserwowano ścisły związek pomiędzy aktywacją szlaku PI3K a rozwojem hormonooporności w przebiegu PCa. W modelach in vitro zaobserwowano, że wzrost i przeżycie komórek PCa przy nieobecności androgenów są możliwe dzięki aktywacji szlaku PI3K. Wykazano również, że w nowotworach stercza o wysokiej złośliwości dochodzi do stymulacji szlaku PI3K. Jednym ze związków wpływającym na regulację PI3K/PTEN/AKT jest gen Bcl-2 (B-cell CLL/lymphoma-2). Bcl-2 wykazuje działanie antyapoptyczne w wielu typach komórek. W gruczole krokowym zwiększona ekspresja genu Bcl-2 związana jest z rozwojem androgenooporności, a liczne doniesienia wskazują na korelację pomiędzy wzrostem ekspresji Bcl-2 a radio- i chemioopornością komórek PCa. Wyniki badań in vitro sugerują również związek między szlakiem PI3K/PTEN/AKT, Bcl-2 a przeżywalnością w raku stercza. Prawdopodobnie wzrost ekspresji Bcl-2 następuje na końcu szlaku PI3K i stanowi ostateczny oraz nieodwracalny etap progresji PCa.

Istnieje coraz więcej dowodów, że u chorych poddanych blokadzie androgenowej dochodzi do pobudzenia szlaku PI3K/PTEN/AKT oraz do wzrostu ekspresji Bcl-2 (ryc. 1).

Doksazosyna to selektywny antagonista receptorów &-1 adrenergicznych powszechnie stosowany w leczeniu łagodnego rozrostu stercza. Podobnie jak pozostałe adrenolityki, prowadzi do rozkurczu mięśni gładkich gruczołu krokowego, zwiększając przepływ cewkowy i strumień oddawanego moczu. Ponadto w ostatnich latach wykazano, że lek ma również zdolność indukcji "zaprogramowanej" śmierci komórek raka stercza, tzw. apoptozy, zarówno in vitro, jak i in vivo. Dodatkowe właściwości doksazosyny wynikają najprawdopodobniej z charakterystycznej struktury związku, tj. obecności pierścienia chinazolinowego. Od kilkunastu lat poszukuje się mechanizmu odpowiedzialnego za proapoptyczne działanie leku.

Celem pracy jest doświadczalne zbadanie związku między śmiercią komórek indukowaną doksazosyną, aktywacją/inhibicją szlaku PI3K/ PTEN/AKT oraz ekspresją genu Bcl-2 w komórkach raka stercza.

Materiał i metoda

Badanie przeprowadzono na modelu in vitro imitującym naturalną progresję raka stercza, pochodzącym z rodzicielskiej linii komórwpływu doksazosyny (25 ?M?100 ?M) na wzrost komórek raka stercza (24?120 godz.) użyto testu MTT Proliferation Assay. Ponadto określano wpływ leku na wszystkie wymienione komórki, hodując je w obecności doksazosyny (0?75 ?M) oraz naskórkowego czynnika wzrostu (EGF; 50 ng/ml) lub dihydrotestosteronu (DHT; 5nM). Aktywność szlaku PI3K/PTEN/AKT oceniano w komórkach pośrednio, mierząc ekspresję p-AKT. Stosując Western blotting, obserwowano zmiany pobudzenia (aktywację/inhibicję) szlaku PI3K odpowiadające fosforylacji/defosforylacji p-AKT. Szlak PI3K aktywowano EGF (50 ng/ml, 20 min), a w komórkach Dar19 dodatkowo DHT (5 nM, 30 min). Badano wpływ doksazosy- ny (50 ?M, 24 godz.) na konstytutywną oraz indukowaną EGF (50 ng/ml, 20 min) lub DHT (5 nM, 30 min) ekspresję p-AKT. Specy- ficzność działania doksazosyny oceniano blokując szlak PI3K/PTEN/AKT swoistym inhibitorem szlaku ? LY294002 (10 ?M, 50 min).

Wyniki

Doksazosyna (25 ?M) doprowadziła do istotnej statystycznie (p < 0,01) śmierci 56% komórek Du145, a w stężeniu 75 ?M i większym indu- kowała prawie całkowitą (p < 0,01) 97% apoptozę. W obu modyfikowanych genetycznie komórkach (Dar19 & Dkc9) zaobserwowano słabsze działanie leku. Doksazosyna (25 ?M oraz 75 ?M) wywołała odpowiednio śmierć 23% (p > 0,05) i 97% (p < 0,01) komórek Dar19 oraz 8% (p > 0,05) i 90% (p < 0,01) komórek Dkc9. EGF (50 ng/ml) częściowo zahamował zależną od doksazosyny śmierć komórek PCa. Zaobserwowano również, że DHT (5 nM) częściowo zapobiega cytotoksycznemu działaniu doksazosyny; największy efekt ochronny DHT zaobserwowano w komórkach androgenowrażliwych (Dar19). Ponadto DHT (5 nM) lub EGF (50 ng/ml) podane osobno, tj. bez skojarzenia z doksazosyną, nie miały istotnego znaczenia dla wzrostu komórek PCa.

Rycina 1	Mechanizm progresji raka stercza zależny od aktywacji szlaku PI3K oraz ekspresji genu Bcl-2

Następnie oceniano wpływ doksazosyny na szlak PI3K/PTEN/AKT. Inkubacja komórek z doksazosyną (50 ?M, 24 godz.) prowadziła do całkowitego zniesienia (Du145) lub obniżenia (Dar19 & Dkc9) konstytutywnej ekspresji p-AKT. Ponadto adrenolityk obniżył (najbardziej w Du145) indukowaną EGF ekspresję p-AKT w badanych komórkach. Doksazosyna nie miała zaś wpływu na ekspresję p-AKT indukowaną DHT (Dar19). LY294002 całkowicie hamował fosforylację AKT indukowaną przez EGF/DHT.

Wnioski

1. Śmierć komórek uwarunkowana obecnością w hodowli doksazosyny może być, przynajmniej częściowo, przypisana hamowaniu alternatywnego szlaku progresji raka stercza PI3K/PTEN/AKT.
2. Komórki linii rodzicielskiej raka stercza z przerzutów do mózgu Du145 [AR(-), Bcl-2(-)], których wzrost nie zależy od androgenów, są najbardziej wrażliwe na śmierć w wyniku leczenia doksazosyną.
3. Nadekspresja genu Bcl-2 znacznie zmniejsza skuteczność działania doksazosyny.

dr n. med. Maciej Salagierski
I Klinika Urologii UM w Łodzi
kierownik kliniki: dr hab. n. med. Marek Sosnowski, prof. nadzw.

Autor wyraża szczególne podziękowania Paniom Doktor: Hannie Romańskiej, Rachel Bruton, Rachel Howe oraz Panu Profesorowi El-Nasirowi Lalaniemu z Zakładu Patologii w Birmingham za nieocenioną pomoc w realizacji projektu oraz za możliwość przeprowadzenia badań w Wielkiej Brytanii. Wykonanie pracy było możliwe dzięki współpracy pomiędzy Zakładem Patologii Uniwersytetu w Birmingham w Wielkiej Brytanii a I Kliniką Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Praca była finansowanaprzezUNIWERSYTETMEDYCZNY W ŁODZI; praca własna: 502?15?499, BRITISH COUNCIL: WAR/341/72 & WAR/342/97 oraz firmęPFIZER;IdependentResearchGrant(IRG):2004?0737.