Apoptoza w wybranych hodowlach pierwotnych i ustalonych komórek nabłonka gruczołu krokowego

Streszczenie rozprawy doktorskiej
Promotor: prof. dr hab. med. Zbigniew Wolski

Wstęp

Zarówno łagodny rozrost stercza, jak i rak powstają w konsekwencji zaburzeń procesów podziałów komórkowych, różnicowania komórek i zaprogramowanej genetycznie śmierci. Nadal bardzo mało wiadomo na temat przebiegu procesu łagodnego rozrostu jak i nowotworzenia w tkance kanalików stercza. Uważa się, że klony komórek nowotworowych pochodzą bezpośrednio z populacji komórek macierzystych budujących daną tkankę.

Obecność komórek macierzystych w nabłonku wydzielniczym stercza potwierdzono badaniem przy użyciu przeciwciał przeciwko cytokeratynom. Komórki macierzyste znajdują się w odcinku proksymalnym kanalików wydzielniczych stercza i są słabo zróżnicowane. Antygen CD133 jest jednym z głównych markerów komórek macierzystych/progenitorowych w sterczu.

Doksazosyna (Dox) indukuje proces apoptozy komórek w nabłonku gruczołowym i zrębie stercza.

Cel pracy

Celem pracy było:

1. Opracowanie metody izolacji i hodowli komórek macierzystych/progenitorowych nabłonka stercza.
2. Porównanie występowania zjawiska apoptozy spontanicznej oraz indukowanej za pomocą doksazosyny, antagonisty receptorów α₁-adrenergicznych stosowanego w leczeniu łagodnego rozrostu stercza, w komórkach macierzystych/progenitorowych i zróżnicowanych komórkach nabłonka stercza ustalonej linii.

Materiał i metody

Materiał do założenia hodowli komórek zróżnicowanych nabłonka stercza, izolacji i hodowli komórek macierzystych/progenitorowych uzyskano od 10 pacjentów poddanych adenomektomii z powodu łagodnego rozrostu stercza. Tkanka została pobrana ze strefy przejściowej wyłuszczonego gruczolaka. Po mechanicznej obróbce i enzymatycznym wyizolowaniu pojedynczych komórek dzielono materiał na dwie części. Pierwszą przenoszono do butelek hodowlanych o powierzchni wzrostu 25 cm2 wypełnionych medium hodowlanym i umieszczano w inkubatorze w atmosferze 5% CO2, temperaturze 370C i stałej wilgotności celem uzyskania hodowli komórek zróżnicowanych. Do drugiej części materiału dodawano przeciwciała anty-CD133 znakowane ferromagnetykiem. Zawiesinę umieszczano w aparacie SuperMACS, gdzie następowała pozytywna selekcja komórek macierzystych w polu magnetycznym. Komórki frakcji pozytywnej (CD133(+)) jak i negatywnej (CD133(-)) przenoszono do butelek hodowlanych wypełnionych medium hodowlanym i umieszczanych w inkubatorze celem uzyskania hodowli komórek macierzystych oraz komórek zróżnicowanych pozbawionych komórek macierzystych. Medium hodowlane zmieniano co 2 dni.

Po około 14 dniach do hodowli dodawano doksazosynę w stężeniach 20 μM/l, 50 μM/l i 80 μM/l. Po 12-godzinnej inkubacji komórki usuwano z butelek hodowlanych i oceniano apoptozę dwiema metodami: po dodaniu błękitu trypanu pod mikroskopem oraz po dodaniu jodku propidyny i aneksyny V w cytometrze przepływowym. Kontrolą były komórki inkubowane w medium hodowlanym bez doksazosyny.

Wyniki

Założono łącznie 172 hodowle: 90 hodowli komórek nabłonka wydzielniczego stercza zawierających zarówno komórki progenitorowe (CD133(+)), jak i komórki zróżnicowane (CD133(-)) określanych jako CD133(+)/CD133(-), 41 hodowli zawierających wysortowane macierzyste/progenitorowe komórki nabłonka wydzielniczego stercza (CD133(+)) oraz 41 hodowli komórek zróżnicowanych nabłonka wydzielniczego pozbawionych komórek macierzystych/progenitorowych (CD133(-)). Po 2 tygodniach w każdej hodowli CD133(+)/CD133(-) było ok. 2x106 komórek. W hodowlach CD133(+) liczba komórek zwiększyła się do ok. 9x104. Hodowle CD133(+)/CD133(-) i CD133(+) wykazywały morfologię taką jak w hodowlach komórek nabłonkowych. Kolonie CD133(+)/CD133(-) wzrastały z grup komórek silnie proliferujących. Kolonie CD133(+) wzrastały z pojedynczych komórek. Nie obserwowano proliferacji komórek określanych jako CD133(-), które obumarły przed upływem dwóch tygodni.

Zarówno ocena żywotności komórek za pomocą testu z błękitem trypanu, jak i ocena częstości występowania apoptozy za pomocą testu z aneksyną V i jodkiem propidyny w hodowlach CD133(+)/CD133(-) po 12 godz. inkubacji z Dox wykazały istotny statystycznie spadek odsetka komórek żywych oraz wzrost odsetka komórek apoptotycznych korelujący ze stężeniem doksazosyny w stosunku do hodowli inkubowanych z czystym medium hodowlanym (kontrola). W hodowlach CD133(+) nie stwierdzono różnic w odsetku komórek żywych i komórek apoptotycznych po 12 godz. inkubacji z doksazosyną w stosunku do kontroli zawierającej czyste medium.

Wnioski

1. Opracowano model pierwotnej krótkoterminowej hodowli komórek macierzystych prawidłowego stercza człowieka.
2. Wykazano, iż do założenia hodowli ustalonej linii komórek zróżnicowanych niezbędna jest obecność komórek macierzystych nabłonka stercza.
3. Stwierdzono, że doksazosyna nie indukuje apoptozy w komórkach macierzystych nabłonka stercza.
4. Różna wrażliwość komórek macierzystych oraz zróżnicowanych na proapoptotyczny wpływ doksazosyny wskazuje, że modele in vitro winny zawierać oddzielne populacje komórek zróżnicowanych, macierzystych oraz ich kokultury. Takie modele badawcze sprzyjać będą otrzymywaniu wyników, których wartość będzie bliższa warunkom klinicznym.
5. Niewrażliwość komórek macierzystych na proapoptotyczny wpływ doksazosyny może być jedną z przyczyn obserwowanego klinicznie braku zmniejszenia masy i wielkości stercza po leczeniu tym antagonistą receptorów α₁-adrenergicznych

dr n. med. Łukasz Pokrywka
Katedra i Klinika Urologii Ogólnej, Onkologicznej i Dziecięcej w Bydgoszczy