Przegląd Urologiczny 2006/4 (38) wersja do druku | skomentuj ten artykuł | szybkie odnośniki
 
strona główna > archiwum > Przegląd Urologiczny 2006/4 (38) > Streszczenie pracy doktorskiej pt....

Streszczenie pracy doktorskiej pt. "Cytotoksyczne działanie ligandu czynnika martwicy nowotworu indukującego apoptozę (TRAIL) na komórki raka pęcherza moczowego po zastosowaniu terapii fotodynamicznej"

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Fotografia 1
Dr med. Ewelina Szliszka

Dr med. Ewelina Szliszka jest laureatką Nagrody im. Profesora Tadeusza Krzeskiego, przyznanej w 2006 roku za najlepszą rozprawę doktorską z dziedziny urologii obronioną w 2005 roku.
Nagroda jest najbardziej prestiżowym wyróżnieniem naukowym PTU. Jej fundatorem jest AstraZeneca, Członek Wspierający Polskiego Towarzystwa Urologicznego.

Rak pęcherza moczowego jest czwartym co do częstości występowania na świecie nowotworem złośliwym u mężczyzn, a ósmym u kobiet. Rocznie w Europie rozpoznaje się średnio 120 tysięcy nowych przypadków zachorowania na ten typ nowotworu i odpowiednio 55 tysięcy w USA. W Polsce stanowi on u mężczyzn 5,5% wszystkich nowotworów złośliwych, a u kobiet 1,2%. Rak przejściowokomórkowy (TCC - transitional cell carcinoma) stanowi ponad 90% guzów pęcherza moczowego. Głównym kryterium oceny stopnia zaawansowania raka jest głębokość naciekania ściany pęcherza moczowego przez komórki nowotworowe. Na tej podstawie można wyróżnić guzy powierzchowne (70%) oraz naciekające (30%). O wyborze metody leczenia raka pęcherza moczowego decyduje przede wszystkim stopień zróżnicowania histopatologicznego oraz stopień miejscowego zaawansowania guza. Wzrastająca zachorowalność oraz brak w pełni skutecznych metod leczenia, a ponadto duża skłonność raka pęcherza moczowego do nawrotu i progresji zmusza do poszukiwania nowych sposobów terapii.

Ligand czynnika martwicy nowotworu indukujący apoptozę (TRAIL - tumor necrosis factor - TNF - related apoptosis inducing ligand) jest białkiem błonowym typu II należącym do rodziny TNF. TRAIL ma zdolność indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych, nie będąc cytotoksycznym w stosunku do prawidłowych komórek organizmu. To wskazuje na rolę TRAIL jako cząsteczki efektorowej w zabijaniu komórek raka oraz na jego potencjalne zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej. Działanie ligandu związane jest z ekspresją odpowiednich receptorów na komórkach docelowych. Należą do nich dwa receptory przekazujące sygnał apoptozy: TRAIL-R1 (DR4) i TRAIL-R2 (DR5, TRICK2, KILLER) oraz trzy receptory nieprzekazujące sygnału apoptozy, którym przypisuje się funkcje "receptorów pułapek": TRAIL-R3 (DcR1, TRID, LIT) i TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD) oraz osteoprotegeryna (OPG). Cząsteczka ligandu ma postać monomeru bądź też trimeru cechującego się dużo większą aktywnością biologiczną. TRAIL może indukować apoptozę przez związanie się z odpowiednim receptorem na komórce docelowej na dwa sposoby: 1) jako forma rozpuszczalna, 2) poprzez limfocyty, neutrofile oraz makrofagi mające na swojej powierzchni ligand TRAIL. Doświadczenia wykazały, że wspomniane ludzkie komórki immunokompetentne stymulowane interferonem α lub γ wywoływały apoptozę w komórkach nowotworowych w podobny sposób jak rozpuszczalny trimer TRAIL. Wykazano, że terapia BCG stosowana jako leczenie uzupełniające nowotworów pęcherza moczowego może powodować wzrost ekspresji TRAIL na komórkach immunokompetentnych naciekających guz i tym samym indukować apoptozę komórek raka w mechanizmie zależnym od tego ligandu.

Badania in vitro wykazały zróżnicowaną wrażliwość komórek nowotworowych na cytotoksyczne działanie TRAIL, warunkowaną ekspresją określonych receptorów TRAIL-R na ich powierzchni i/lub obecnością białek inhibitorów transdukcji sygnału do apoptozy. Wstępne obserwacje świadczą, że TRAIL ma zdolność selektywnej indukcji apoptozy w komórkach ponad 60% badanych linii nowotworowych. Wywołanie apoptozy w komórkach nowotworowych mediowanej przez TRAIL jest często warunkowane współdziałaniem czynników fizycznych (promieniowanie γ -jonizujące) lub czynników chemicznych (cytostatyków, cytokin).

Wstępne badania nad apoptozą limfocytów linii JURKAT poddanych skojarzonemu działaniu terapii fotodynamicznej oraz rekombinowanego TRAIL wskazują również na skuteczność tej terapii. Na podstawie wyników tych eksperymentów można wysunąć hipotezę, że PDT może uwrażliwiać komórki raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego na działanie TRAIL.

W leczeniu wielu schorzeń onkologicznych terapia fotodynamiczna coraz częściej wspomaga techniki chirurgiczne bądź radioterapię. Podejmowane są również próby łączenia PDT z immunoterapią. W powierzchownych guzach TCC pęcherza moczowego ze względu na ich wieloogniskowe występowanie, dużą skłonność do wznowy oraz ryzyko naciekania ściany pęcherza PDT znajduje coraz szersze zastosowanie jako leczenie podstawowe lub adjuwantowe. Dzięki złożonym procesom fizykochemicznym, które zachodzą w tkankach po aktywacji światłem podanego wcześniej światłoczułego związku chemicznego, następuje zniszczenie struktur komórkowych w obszarze zmian patologicznych. Procesy te noszą nazwę reakcji fotocytotoksycznych. Efekty terapii fotodynamicznej obserwowane są na poziomie molekularnym, subkomórkowym, komórkowym i tkankowym. O pożądanym, skutecznym działaniu terapeutycznym decyduje między innymi właściwy dobór fotouczulacza, jak również długości fali światła. śmierć komórek następuje na drodze: apoptozy, która jest indukowana małymi dawkami PDT, z miejscowym podaniem fotouczulacza i nekrozy, zachodzącej przy efektywnej, dużej dawce PDT, z ogólnoustrojowym podaniem barwnika. Obecnie w PDT stosuje się szereg związków fotoaktywnych. W terapii fotodynamicznej raka pęcherza moczowego coraz szersze zastosowanie obok kwasu δ -aminolewulinowego (ALA) znajduje hyperycyna i jej pochodne.

Celem podjętych badań jest ocena cytotoksycznego działania TRAIL na komórki linii raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego o różnym stopniu zróżnicowania histopatologicznego po zastosowaniu terapii fotodynamicznej.

Badaniami objęto komórki trzech ludzkich linii raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego: SW780 (G1), 647V (G2) i T24 (G3) zakupione w American Type Culture Collection (Manassas, USA) oraz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Niemcy). Zastosowano ludzki, rozpuszczalny, rekombinowany SuperKillerTRAIL: rhsTRAIL (firmy Alexis, San Diego, USA).

W pierwszej części eksperymentu badano wrażliwość komórek TCC na działanie rhsTRAIL w zakresie stężeń 5-150 ng/ml. Cytotoksyczność wyrażoną procentem zabitych komórek nowotworowych oznaczano w teście MTT polegającym na pomiarze aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej oraz w teście LDH polegającym na pomiarze aktywności dehydrogenazy mleczanowej. Zaobserwowano, że komórki SW780 wykazywały wysoką wrażliwość na działanie TRAIL w stężeniu 50 ng/ml (91,5±2,0% zabitych komórek), zaś komórki 647V i T24 charakteryzowały się opornością na działanie tego ligandu (odpowiednio 34,3±1,9% i 29,9±2,8% zabitych komórek). Zastosowanie wyż- szych stężeń ligandu, równych 100 ng/ml i 150 ng/ml, nie wpłynęło znamiennie na wzrost jego cytotoksyczności w stosunku do komórek TCC. W badanych stężeniach 5-150 ng/ml TRAIL nie wywoływał lizy komórek raka pęcherza moczowego określanej w teście LDH. W dalszych etapach eksperymentu zastosowano TRAIL w stężeniach: 5 ng/ml, 10 ng/ml i 50 ng/ml.

Komórki nowotworowe oporne na apoptozę indukowaną TRAIL można uwrażliwiać stosując szereg czynników przeciwnowotworowych. Modelowym związkiem wspomagającym działanie ligandu jest cisplatyna. W stężeniu 10 mg/ml cisplatyna wykazywała zbliżony efekt cytotoksyczny dla komórek poszczególnych linii TCC (16,4±3,6-28,0±9,4%). W przypadku komórek 647V i T24 obserwowano zwiększenie efektu cytotoksycznego wywołanego przez TRAIL po zastosowaniu cisplatyny. Cytostatyk ten zwiększał wrażliwość (przełamywał oporność) tych komórek na działanie ligandu. Dla tych komórek cytotoksyczność po zastosowaniu wyłącznie TRAIL w stężeniu 50 ng/ml wynosiła od 26,5±0,9% do 29,9±2,8%, zaś cisplatyna zwiększy ła ten efekt do 45,9±4,1% - 54,1 ±1,1%. Podobne zjawisko obserwowano również dla niższych stężeń ligandu: 5 ng/ml i 10 ng/ml. W stosunku do komórek SW780 wrażliwych na działanie TRAIL nie odnotowano analogicznego efektu w tym samym zakresie stężeń.

Analiza mechanizmów uwrażliwienia komórek nowotworowych na działanie TRAIL pozwala na wysunięcie hipotezy, że zastosowanie terapii fotodynamicznej może okazać się skuteczne w działaniu skojarzonym z ligandem. W dostępnym piśmiennictwie odnotowano doniesienie dotyczące zastosowania kombinacji PDT z TRAIL w stosunku do ludzkich komórek linii Jurkat wywodzących się z białaczki limfoblastycznej T. Niskie dawki PDT potęgowały apoptozę tych komórek indukowaną TRAIL. Brak natomiast danych opisujących zastosowanie terapii fotodynamicznej w skojarzeniu z TRAIL w stosunku do komórek nowotworowych litych guzów. Kontynuując własne badania oceniałam in vitro cytotoksyczne działanie TRAIL na komórki raka przejściowokomórkowego wywodzące się z guzów pęcherza moczowego po zastosowaniu PDT. Badania nad zastosowaniem kombinacji PDT i TRAIL zostały poprzedzone cyklem doświadczeń określających działania samej terapii fotodynamicznej w stosunku do wybranych przeze mnie komórek linii TCC. Wykorzystując wyniki doświadczeń Granville'a i współpracowników dotyczące zastosowania kombinacji PDT z TRAIL na komórki Jurkat, dobrano warunki terapii fotodynamicznej. Parametry PDT (bez ligandu) ustalono tak, aby cytotoksyczność badanych komórek wynosiła poniżej 50%. Ze względu na brak standaryzacji i niejednoznaczny opis warunków eksperymentów z zastosowaniem PDT prowadzonych przez innych autorów zaistniała konieczność wypracowania własnego komórkowego modelu doświadczalnego. Działanie PDT w dużej mierze zależało od rodzaju zastosowanego fotouczulacza. W doświadczeniach użyłam dwóch fotouczulaczy o różnej budowie chemicznej: kwasu δ -aminolewulinowego i hyperycyny. Obydwa fotosensybilizatory znalazły kliniczne zastosowanie w terapii fotodynamicznej raka pęcherza moczowego. Ponadto efekt fotocytotoksyczny zależał między innymi od stężenia użytego fotouczulacza, czasu inkubacji komórek z fotouczulaczem oraz czasu i charakterystyki stosowanego promieniowania. Porównanie wartości cytotoksyczności uzyskanych w teście MTT i stopnia lizy mierzonego aktywnością LDH w supernatancie wskazuje, że kwas δ -aminolewulinowy w badanych stężeniach nie powoduje nekrozy komórek, a do ich śmierci dochodzi prawdopodobnie na drodze apoptozy. Użycie hyperycyny w stężeniu 0,25 μM i 0,5 μM prowadzi do częściowej lizy komórek 647V i T24. Obserwacja ta ma praktyczne znaczenie i może wiązać się z efektami ubocznymi po zastosowaniu PDT. Wyniki wcześniejszych badań zespołu z Vancouver dowodzą, że terapia fotodynamiczna może nasilać cytotoksyczne działanie TRAIL na komórki Jurkat. Na ich podstawie zaobserwowano, że terapia skojarzona PDT z ligandem TRAIL zwiększała liczbę komórek ulegających apoptozie z 10 do 36%. Granville i współpracownicy wykazali również znamienny wzrost aktywności kaspazy 3, 6, 8 i 9 w lizacie komórek Jurkat poddanych skojarzonemu działaniu PDT i TRAIL w stosunku do działania samego ligandu lub tylko PDT. W swoich badaniach również zaobserwowałam, że zastosowanie niskich dawek terapii fotodynamicznej nasila cytotoksyczne działanie TRAIL. Efekt działania kombinacji PDT z kwasem δ-aminolewulinowym w stężeniu 25 μM i ligandu w stężeniu 50 ng/ml w stosunku do komórek TCC wynosił odpowiednio: dla SW780-98,9 ±0,6%, 647V-67,2±5,0% oraz T24-45,5±1,5%. Skojarzona terapia fotodynamiczna z ALA i TRAIL zwiększyła procent zabitych komórek raka pęcherza moczowego zależnie od użytego stężenia ligandu średnio od 8 do 37% dla komórek linii SW780, 25-36% dla komórek 647V i 15-19% dla komórek T24. Efekt działania kombinacji PDT z hyperycyną w stężeniu 0,25 μM i TRAIL w stężeniu 50 ng/ml w stosunku do badanych komórek wynosił odpowiednio: dla SW780-96,3-0,6%, 647V-79,4±1,6% oraz T24-67,6±0,5%. W przypadku komórek opornych (647V i T24) skojarzenie PDT z hyperycyną w wyżej wymienionym stężeniu i TRAIL w zakresie stężeń 5-50 ng/ml znacznie zwiększyło cytotoksyczny efekt w porównaniu z działaniem samego ligandu. Natomiast zastosowanie PDT z użyciem hyperycyny w stężeniu 0,1 μM nasiliło cytotoksyczny efekt działania TRAIL zwłaszcza w zakresie niskich stężeń w stosunku do komórek SW780. Podobny efekt, ale w zakresie wszystkich badanych stężeń ligandu obserwowano w stosunku do komórek T24. Nie odnotowano natomiast analogicznego efektu w przypadku komórek 647V. Obserwacje te wskazują na istotne znaczenie stężenia fotouczulacza użytego w PDT na mechanizm uwrażliwiania komórek na cytotoksyczne działanie ligandu oraz rolę dobranych parametrów terapii fotodynamicznej.

Jak wcześniej wielokrotnie podkreślano, śmierć komórki w wyniku działania TRAIL zachodzi na drodze apoptozy. Przełamanie oporności w przypadku komórek 647V i T24 poprzez zastosowanie PDT w niskich stężeniach fotouczulacza prowadzi do śmierci komórek również na drodze apoptozy, natomiast wysokie stężenia mogą uruchamiać proces lizy komórek prowadzący do ich nekrozy.

Podsumowując otrzymane wyniki można stwierdzić, że badane komórki TCC charakteryzowały się zróżnicowaną wrażliwością na cytotoksyczne działanie ligandu, podobnie jak komórki linii nowotworowych opisane przez innych autorów. Podjęte przeze mnie badania nad udziałem terapii fotodynamicznej w przełamywaniu oporności komórek nowotworowych litych guzów mają charakter pionierski, bowiem w dostępnych medycznych bazach danych nie znalazłam ani jednej wzmianki na ten temat. Odnotowano tylko doniesienie Granville'a i współautorów opisujące takie działanie w stosunku do komórek limfoblastycznych linii Jurkat. W związku z czym wyniki moich badań mogę odnieść do tych uzyskanych przez wyżej wymienionych badaczy jedynie na zasadzie pewnej analogii. Nadal pozostaje otwarte pytanie, czy obserwowany cytotoksyczny efekt zastosowania kombinacji PDT z TRAIL związany jest z addytywnym czy raczej synergistycznym działaniem poszczególnych czynników. Niemniej jednak uzyskane wyniki zachęcają do dalszych badań nad poznaniem mechanizmów uwrażliwienia komórek nowotworowych na działanie TRAIL za pomocą terapii fotodynamicznej, podobnie jak to ma miejsce w przypadku chemio-, radio- lub immunoterapii. Biorąc pod uwagę zakres przeprowadzonych przeze mnie eksperymentów, określenie strategii przełamywania oporności komórek raka pęcherza na działanie ligandu z udziałem PDT wymaga kontynuacji badań uwzględniających molekularne aspekty apoptozy indukowanej przez TRAIL.

Wniosek

Traktowanie komórek raka pęcherza moczowego PDT potęgowało cytotoksyczne działanie ligandu na komórki SW780, 647V i T24. Zastosowanie kombinacji TRAIL z cisplatyną zwiększyło cytotoksyczny efekt w stosunku do komórek 647V i T24. Uzyskane wyniki potwierdzaj ą, że terapia fotodynamiczna lub cisplatyna mogą przełamywać oporność komórek nowotworowych na działanie TRAIL. Wskazuje to na możliwość zastosowania w przyszłości takiej skojarzonej terapii TRAIL z PDT lub TRAIL z cisplatyną w leczeniu pacjentów z guzami pęcherza moczowego.